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问题
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可能原因
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可能采取的措施
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背景高且均一
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1.抗体浓度过高
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降低抗体（一抗/二抗）浓度
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2.封闭液选择不当
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比较不同封闭液
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3.封闭不完全
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根据不同的体系优化封闭液
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提高封闭物浓度
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优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜
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在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20
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用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体
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4.抗体与封闭液中其他蛋白发生交叉反应
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更换封闭液
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avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin
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检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测
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5.清洗不充分
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增加清洗次数及清洗液体积
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如果之前未添加Tween-20，可添加Tween-20至终浓度0.05%
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6.曝光时间过长
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缩短曝光时间
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7.膜出问题
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确保转膜前，已根据厂商指导将膜彻底浸润
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更换新膜
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确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉
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避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子
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每一步孵育都应确保充分
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8.缓冲液污染或长菌
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重新配制缓冲液
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背景高，且以斑点形式存在
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1.抗体浓度过高
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降低抗体（一抗/二抗）浓度
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2.封闭液选择不当
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比较不同封闭液
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3.封闭不完全
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根据不同的体系优化封闭液
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提高封闭物浓度
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优化封闭时间和（或）温度，室温下至少1小时或4℃过夜
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在封闭液中添加终浓度0.05%的Tween-20
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用含终浓度0.05%的Tween-20的封闭液稀释抗体
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4.抗体与封闭液中其他蛋白发生交叉反应
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更换封闭液
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avidin-biotin系统避免使用奶粉，奶粉中含有biotin
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检测交叉反应：封闭一张干净的不含蛋白的膜，抗体孵育后检测
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5.膜出问题
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确保转膜前，已根据厂商建议将膜彻底浸润
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避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子
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更换新膜
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确保膜始终有足够的液体覆盖，避免干掉
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每一步孵育都应确保充分
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膜过多时，应避免相互堆叠
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操作时应小心，对膜造成的损伤会产生非特异性反应
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6.缓冲液污染
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使用新的缓冲液
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用前过滤
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7.仪器污染
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确保转膜仪、杂交仪等仪器清洁无污染
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确保转膜后膜上没有残留的胶
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信号弱或无信号
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1.转膜效率低
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转膜结束后，染胶以确定转膜效率
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转膜时胶与膜应充分接触
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确保转膜时滤纸与膜装配正确
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按厂商指导将膜充分浸润
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转膜体系在转膜过程中避免过热
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使用阳性对照和（或）分子量marker
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优化转膜时间和电流
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确保在抗体杂交前的样品制备条件没有破坏样品的抗原性（注意：某些蛋白不能在变性条件下电泳）
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2.蛋白与膜结合不充分
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在转膜缓冲液中添加20%的甲醇
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低分子量的蛋白使用孔径较小的膜
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3.抗体量不足
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增加抗体浓度
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抗体可能已经失效，通过点杂交确定抗体活性
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4.抗体浓度过高
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抗体浓度过高会导致信号迅速减弱，造成信号弱的假象
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5.抗原量不足
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增加上样量
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6.抗原被封闭液掩盖
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更换封闭液
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优化封闭液浓度
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7.缓冲液中含有叠氮化钠
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叠氮化钠是辣根过氧化酶的抑制剂
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8.曝光时间过短
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延长曝光时间
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9.底物反应时间过短
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延长反应时间至5分钟
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10.底物失活
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检查底物活性
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确保两瓶底物之间没有交叉污染
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11.剥膜造成影响
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剥膜造成有些抗原丢失或变性，优化剥膜过程
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仅在必需时剥膜重杂
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避免反复剥同一张膜
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12.膜上抗原降解
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某些封闭物具有蛋白水解活性（如gelatin）
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13.转好的膜存放时间过长
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重新电泳转膜
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非特异性条带
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1. 抗体浓度过高
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降低抗体浓度
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2.SDS造成非特异性结合
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转膜结束后清洗膜
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免疫反应过程中避免使用SDS
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3. 二抗试剂的非特异结合
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更换二抗
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4.一抗特异性差
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采用单抗或亲和纯化的抗体
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弥散条带
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1.抗体浓度过高
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降低抗体浓度
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2.上样量过高
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减少上样量
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条带曝空或淬灭迅速
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抗体浓度过高
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降低抗体浓度，尤其是二抗浓度
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仅局部区域有信号
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转膜不完全
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确保在胶和膜之间没有气泡
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根据厂商指导将膜彻底浸润
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避免徒手操作，应配戴手套，使用镊子
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更换新膜
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膜过多时，应避免相互堆叠
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