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免疫沉淀 |
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产生的问题 |
产生问题的原因 |
解决办法 |
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没有得到目的蛋白或者得到的目的蛋白太少 |
1.目的蛋白在样品中含量太低或者检测样品中没有目的蛋白 |
更换样品或者在细胞中过表达目的基因 |
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2.加入的proteinA/G-beads太少或者与一抗的结合属性不匹配 |
增加proteinA/G-beads至60ul/mg总蛋白；检查proteinA/G-beads与一抗的结合属性 |
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3.抗体或者proteinA/G-beads与样品作用时间太短 |
正确按照protocol操作，抗体或者proteinA/G-beads与样品作用时间最短不能少于2小时 |
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4.蛋白发生降解 |
尽量使用新鲜制备样品进行免疫沉淀实验；将样品至于冰上或者在冷库中操作 |
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5.杂蛋白太多 |
加入抗体和proteinA/G-beads前100，000g离心细胞30 min以去除膜成分或者不可溶蛋白 |
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6.目的蛋白没有溶解或者溶解不充分 |
针对目的蛋白的特性选择合适的裂解液 |
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7.抗体使用浓度太低 |
提高抗体使用浓度 |
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8.抗体亲和力差 |
更换亲和力更高的抗体 |
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9.抗体所识别的抗原表位被相互作用蛋白所遮蔽,无法与目的蛋白相互作用 |
更换抗体 |
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10.抗体选择不合适,所选择的抗体不能识别处于天然构象的蛋白 |
更换抗体 |
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11.抗体或者proteinA/G-beads与样品作用时间太短 |
正确按照protocol操作，抗体或者proteinA/G-beads与样品作用时间最短不能少于2小时 |
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12.洗涤条件过于剧烈 |
减少洗涤次数；降低洗涤缓冲液中的盐浓度或者更换更温和的去垢剂 |
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13.检测灵敏度不够 |
更换检测试剂(针对WB检测)或者提高检测水平(针对质谱检测) |
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有非特异性相互作用或者严重的交叉反应 |
1.Protein A/G-beads对蛋白的非特异性吸附或者样品中有其它蛋白与Protein A/G-beads有交叉反应 |
用ProteinA/G-beads对细胞进行预处理去除非特异性吸附蛋白,然后再加入抗体；加入2%BSA于ProteinA/G-beads中对beads进行预封闭 |
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2.抗体特异性不好 |
更换抗体或者设立阴性对照(IgG或者其它无关抗体) |
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3.裂解液配方过于温和 |
使用条件更加剧烈的裂解液配方 (比如RIPA缓冲液) |
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4.洗脱条件过于温和 |
使用高盐(大于150nM NaCl)或者其它强表面活性剂洗脱 |
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目的蛋白大小与IgG的重链和轻链接近,影响检测 |
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使用不同种属的抗体分别进行IP和WB实验 |
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使用交联剂DSS将一抗与ProteinA/G-beads共价偶联后进行免疫沉淀实验 |