IHC所用试剂配置
1．H2O2-甲醇：一份3%H2O2，加9份纯甲醇原液。
2．0.01M PBS PH7.4
3．PBST工作液（0.01M PH7.4 PBS，0.05%Tween20） 1L PBS中加0.5mL Tween20，混匀。
4．0.01M柠檬酸缓冲液：柠檬酸（C6H8O7.H2O MW201.4） 0.6g 柠檬酸三钠（NaC6H5O7.2H2O MW294.1） 2.1g 溶于1L蒸馏水中。
组织切片的处理
1． 脱蜡和水化。从4℃取出的石蜡组织切片，在烤箱中60℃烘烤60分钟，然后置于玻片架中浸于100％二甲苯溶液缸中，5分钟后转入第二个100％二甲苯溶液缸，浸泡5分钟，转入100％酒精溶液缸中，浸泡5分钟，转入第二个100％酒精溶液缸中，再浸泡5分钟后转入95％酒精溶液缸中浸泡5分钟，转入85％酒精溶液缸中浸泡5分钟，最后转入75％酒精溶液缸浸泡5分钟。
2． 取出切片，用蒸馏水漂洗2次，每次2分钟。之后浸入PBS溶液缸中5分钟后转入第二个PBS溶液缸中，5分钟后取出切片用蒸馏水漂洗2分钟，待用。
抗原修复
用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片。
1．热修复法
（1）高压锅修复法
加1mM EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸（柠檬酸）钠缓冲溶液（pH6.0）于压力锅中，大火加热直至沸腾，将脱蜡水化的组织切片置于玻片架上，放入已沸腾的缓冲液中。盖上压力锅盖，继续加热至喷汽，从喷气开始计时，1~2分钟后压力锅离开热源，冷却至室温，取出切片，蒸馏水冲洗两次，再用PBS（0.01M pH7.4）漂洗三次，每次3~5分钟。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
（2）煮沸热修复
切片脱蜡至水后，放入盛有0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0，工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。该方法效果较微波和高压修复差。
（3）微波加热方法
切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，冷却至室温（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。取出切片蒸馏水冲洗两次，PBS（0.01M pH7.4）洗2分钟×3次，下接免疫组化染色步骤。
2．酶消化方法
（1）胰蛋白酶消化法
用0.1%胰蛋白酶，将切片放入湿盒内37℃温箱中消化5~30分钟。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃。胰酶的最终浓度可以根据使用者的要求进行调整，浓度范围可以从0.05%至0.25%。
（2）胃蛋白酶消化法
用0.4%胃蛋白酶液，根据具体情况37℃孵育10~180分钟。
（3）链霉蛋白酶消化法
将链霉蛋白酶溶于0.5mol/LpH7.4的Tris~HCL中，工作浓度为0.1％，消化时间20min。
（4）蛋白酶K
用0.3mg/ml 37℃消化6~20mins，蒸馏水洗；95℃加热3mins, 灭活残余的蛋白酶。
免疫组织化学染色
⒈ S-P法
1) (如抗原修复前已用H2O2处理则直接从第二步开始)擦干玻片上组织切片周围水分，视组织块大小加50~100μL 3%H2O2-甲醇溶液滴加在组织切片上，室温孵育10分钟。PBS淋洗2～3分钟之后浸泡于PBS的染色缸中漂洗5分钟，漂洗两次。
2) 擦干玻片上组织切片周围水分，视组织块大小加50~100μL非免疫动物血清或1%的BSA封闭液，室温下封闭20~30分钟，甩掉封闭液，不要洗。
3) 擦干玻片上组织切片周围水分，保持组织湿润，但无明显水分（尽量甩干，以免稀释一抗，加二抗和SP的操作也同此）。放在保湿盒中，视组织块大小加50~100μl待测第一抗体使完全覆盖组织，在37℃孵育30分钟或室温40分钟或4℃过夜（4℃过夜后最好在37℃复温30分钟）。用PBST先淋洗，再浸于PBST中漂洗5分钟×3次。
4) 擦干组织切片周围水分，保持组织湿润，但无明显水分。视组织块大小加50~100μL Biotin （生物素）标记的第二抗体，使完全覆盖组织，于湿盒中37℃孵育30分钟或室温40分钟，甩掉第二抗体，用PBST先淋洗，再漂洗5分钟×3次。
5) 擦干组织切片周围水分，保持组织湿润，但无明显水分。视组织块大小加50~100μL SP液，完全覆盖组织，在湿盒中，37℃孵育30分钟或室温40分钟。甩掉SP液，用PBST先淋洗，再漂洗5分钟×3次。
6) 擦干组织切片周围水分，保持组织湿润，但无明显水分。视组织块大小加50~100μL DAB显色剂（现配现用，配好后避光30分钟有效），室温中5~15分钟之内，在显微镜下观察阳性对照显色情况，待出现理想阳性显色且无明显背景时终止显色。在蒸馏水中漂洗干净。
7) 把玻片放玻片架中，放入苏木素中复染，室温下作用30秒（视苏木素液的性能而定时间的长短），PBS或自来水冲洗返蓝。
8) 脱水透明：将组织切片浸泡于85%的酒精缸中，5分钟后转入95%的酒精缸中， 5分钟后转入另一95%的酒精缸中， 5分钟后转入100%的酒精缸中， 5分钟后转入另一100%的酒精缸中，5分钟后转入100%的二甲苯缸中，5分钟后转入另一100%的二甲苯缸中，浸泡5分钟。
9) 中性树胶封片。
2．二步法
1~3步同S-P法的前三步。
接着直接加稀释好的酶标羊抗鼠/兔IgG聚合物，使完全覆盖组织，于湿盒中37℃孵育10-15min，甩掉第二抗体，用PBST先淋洗，再漂洗5分钟×3次。
下面同S-P法步骤6~9。