实验准备

固定液: 4% paraformaldehyde (新鲜配制)

破膜液: 0.1% Triton X-100

封闭液: 1% BSA

Ca²⁺/Mg²⁺-free PBS, pH 7.4

Mounting medium

指甲油

1. 固定细胞

1.1 从细胞组得到长有细胞的盖玻片(在6孔板中)

1.2 吸去培养液,加入PBS rinse两次.

1.3 加入1ml 4% paraformaldehyde,室温孵育15分钟.

1.4 吸去paraformaldehyde, 加入PBS, rinse两次

1.5 加入2ml PBS洗5分钟(摇床缓慢摇晃). 重复一次.

2. 破膜

2.1 吸去PBS, 加入1ml 0.1% Triton X-100, 室温孵育15分钟

2.2 吸去Triton X-100, 加入PBS, rinse两次

2.3 加入2ml PBS洗5分钟(摇床缓慢摇晃). 重复一次.

3. 封闭

加入1ml 1% BSA/PBS, 37°C孵育30分钟或室温1小时

     (a) 一抗

3.1 将纯化后抗体按比例稀释在1%BSA/PBS中(阳性对照一为beta-tubulin抗体或tag抗体, GFP除外)

3.2 滴100-200ml抗体稀释液在封闭好的盖玻片上,将盖玻片放置在放有湿纸的密闭盒子中,室温孵育1小时

3.3 加入PBS, rinse两次

3.4 加入2ml PBS洗10分钟(摇床缓慢摇晃). 重复两次.

     (b) 二抗

3.5 将带红色荧光标签(Rhodmin)的抗小鼠IgG按产品要求稀释在1%BSA/PBS中

3.6 滴100-200ml抗体稀释液在封闭好的盖玻片上,将盖玻片放置在放有湿纸的密闭盒子中,室温孵育1小时

3.7 加入PBS, rinse两次

3.8 加入2ml PBS洗10分钟(摇床缓慢摇晃). 重复两次.每孔加1ml DAPI 10分钟.

     (c) 装片

3.9 取一片载玻片, 滴一滴mounting medium在载玻片上. 将洗好的盖玻片晾干后细胞面朝下盖在mounting medium上.

3.10 小心将指甲油涂在盖玻片四周.晾干.

     (d) 荧光显微镜镜检

3.11 将荧光显微镜调到相应的荧光标签的波长,观察红色荧光的分布(纯化后抗体),拍照

3.12 将荧光显微镜调到相应的荧光标签的波长,观察绿色荧光(GFP)的分布(tag蛋白),拍照