该产品为一款总膜蛋白提取试剂盒，快速且可重复的方法，基于温度依赖的相分离，制备高度富集膜蛋白和疏水蛋白。

同时试剂盒中含有配套的膜蛋白内参抗体（T55159，Sodium Potassium ATPase Antibody）。

1. 细胞准备

常规动物培养细胞在本流程下膜蛋白得率约为：2-4 mg/1x10⁸细胞，建议操作细胞量gt;1x10⁷细胞。细胞可在贴壁培养或悬浮培养下至活性浓度，一般为接近但未达饱和密度，例如80%满的贴壁密度，悬浮细胞约在1-2x10⁶/ml。过高的培养密度会导致死细胞增多，在蛋白提取过程中引入更多的碎片污染，例如DNA纤维沉淀。悬浮培养细胞在提取前离心去上清，1xPBS洗2遍去除培养基后重悬于1xPBS并计数备用，计数时需要使用肽酚蓝检测活细胞比例gt;90%。贴壁细胞使用胰酶或其它解离方法解离为单细胞悬液，一般推荐1xPBS含1mM EDTA 37°C处理10 min以上（不同细胞处理时间有差异）以减小对膜蛋白组的影响，细胞悬液以与悬浮培养细胞的方式洗涤与重悬计数备用。

2. 溶液准备

2.1 自备溶液：1x PBS，500mM EDTA（与1xPBS 1:500稀释制备细胞解离液用）

2.2 胞浆蛋白释放缓冲液A【适用大多数培养细胞，部分细胞系对缓冲液A较为敏感，在缓冲液A处理下会释放较多的DNA污染，表现为在缓冲液A处理下，溶液中会出现较多絮状DNA沉淀，导致包裹为细胞团，影响提取效率与产生污染，出现这种情况时使用胞浆蛋白释放缓冲液B】；

2.3 胞浆蛋白释放缓冲液B（A液备选）；

2.4 缓冲液C；

2.5 蛋白酶抑制剂（货号：A10004，200×，需额外购买，或者使用其他蛋白酶抑制剂）

3. 膜蛋白提取流程

3.1 预先在需要使用到的缓冲液A/B和缓冲液C中加入蛋白酶抑制剂混匀，各缓冲液4°C保存。

3.2 1x PBS重悬并计数好的细胞 1000 g离心5 min，弃上清。

3.3 立即按 2ml/ 1x10⁷细胞比例加入胞浆蛋白释放缓冲液A或B，充分混匀，在4°C冰浴下摇床温和混匀10 min。细胞系首次实验可先使用缓冲液A液，如果在A液中出现显著絮状DNA

释放，则需要更改为缓冲液B液。缓冲液A的加样比例根据细胞大小可作调整，一些血液来源细胞系细胞体积较小，与常规贴壁细胞系有明显差异，缓冲液A量可根据细胞体积差异与离心后的沉淀体积调整，例如人B细胞与T细胞来源细胞系，细胞体积可为常规贴壁细胞的1/10以下，缓冲液A可用到2 ml/1x10⁸细胞。

3.4 14,000 rpm 4°C离心10 min，收集上清为胞浆蛋白提取液，沉淀按 0.2 ml/1x10⁷细胞比例加缓冲液C，吹打混匀后，4°C摇床温和混匀30 min。

3.5 14,000 rpm 4°C离心10 min，收集上清为即为胞膜蛋白提取液。

3.6 上述收集的各蛋白组分进行蛋白定量，推荐氨基黑法，或稀释5倍以上用Bradford法测定。也可以使用BCA定量，但是准确度不高，只能用来调平上样量。

3.7 膜蛋白富集质检：各蛋白提取上清组分，制备为SDS蛋白裂解液，推荐蛋白浓度1 mg/ml以上，用于后续WB分析。WB分析时，使用试剂盒所带的膜蛋白内参抗体作为内参。（同时建议带上GAPDH作为对照内参，判断胞浆蛋白残留情况，参考结果见下图）

T55159 Sodium Potassium ATPase Antibody信息

Description：This is the catalytic component of the active enzyme, which catalyzes the hydrolysis of ATP coupled with the exchange of sodium and potassium ions across the plasma membrane. This action creates the electrochemical gradient of sodium and potassium ions, providing the energy for active transport of various nutrients.

UniProt：P05023

Mol Weight：100kDa

Isotype：Rabbit IgG

Reactivity：Human,Mouse, Rat, Pig, Bovine, Sheep, Dog, chicken

Application：WB 1:5000~1:10000 IHC 1:50~1:100 ICC/IF 1:50~1:200 FC 1:50

产品网页：http://www.ab-mart.com.cn/page.aspx?node=%2077%20amp;id=%201449