免疫共沉淀CoIP试剂盒为准备细胞/组织提取物，抗原结合，洗脱步骤提供最优化的缓冲液.试剂盒中提供的ProteinA/G磁珠，比起传统的protein A或者protein G树脂，有更广的，更高效价的抗体亚型结合能力。同时相比较琼脂糖介质非特异吸附更少，更适合用于功能性实验，例如蛋白质或者蛋白质复合物的IP/Co-IP。

4oC保存，不要-20oC保存。

注： Lysis buffer 使用前，立刻加入蛋白酶抑制剂（推荐购买A10004复合型蛋白酶抑制剂）。

A. 制备细胞裂解物

1. 吸干培养基。添加含有调节分子的新鲜培养基，使其在预定的时间内对细胞进行处理。

2. 收集细胞，去除培养基后用冰预冷的 1X PBS 洗涤细胞一次。

3. 去除PBS，并在并在细胞培养容器中加入适量的已经添加了Cock tail蛋白酶抑制剂的Lysis buffer。每10⁷个细胞加入1ml 冰预冷的 Lysis buffe（相当于100mm的培养皿，15cm²的培养瓶），并在冰上孵育至少 5分钟。

4. 从板上刮下细胞，把提取物转移至微量离心管。置于冰上。

5. 在冰上进行 3 次超声破碎，每次 5 秒。

6. 在 4°C，在 14,000 x g 条件下，微量离心 10 分钟，将上清转移到新管中。上清液即为细胞裂解物。如有必要，裂解物可保存在 –80°C。

注：细胞裂解物制备好之后，可先进行蛋白免疫印迹法检测，以此来确定细胞裂解物里存在目标蛋白。

B. 抗原抗体结合

1. 在新的离心管内加入500μl（含总蛋白200-1000ug）细胞裂解物。

2. 加入目标蛋白的单克隆/多克隆抗体（根据抗体使用说明书，一般3-5ul）。

3. 同时采用非特异免疫的同源抗体作为对照。

4. 在 4℃轻柔混合过夜。

C. 免疫复合物沉淀

1. 抗体孵育过夜后，加入20-40μl Protein A/G 磁珠。

2. 在4℃温和地混匀1-3小时或过夜。

3. 用磁力架吸住磁珠，缓慢吸走上清，保留沉淀。

4. 使用0.5ml 1*Wash buffer清洗沉淀，用磁力架吸住磁珠，缓慢吸走上清，保留沉淀。

5. 重复第4步，共计清洗3次。

注：清洗，去上清的时候需要注意避免吸走磁珠。

D. 用蛋白免疫印迹法进行分析

1. 在 50-200μl 1* SDS 样品缓冲液中重悬沉淀物。涡旋振荡，然后再微量离心 30 秒。

2. 将样品加热至 95–100°C 并持续 2-5 分钟。

3. 用磁力架吸住磁珠，吸取上清中的样品 (15-30 μl) 上样到 SDS-PAGE 凝胶上。

4. 用蛋白质印迹法分析样品。

如果抗体轻重链污染会影响结果分析，可选择Abmart的避重轻链二抗来解决这个问题，产品货号：M21008。

注意事项

实验前：为了获得更好的实验结果，所有的步骤均需要根据实际情况进行优化。

例如：根据细胞系或被捕获的抗原后续用途的不同可选择更加合适的细胞裂解条件。对于没有细胞壁结构的哺乳动物细胞，可以直接使用去污剂进行裂解，但其它细胞，则需要一些机械剪切力辅助，例如超声破碎。以下列出的（包括裂解液、孵育时间、体积及浓度）是作为初始尝试的条件建议，zui终的优化需要根据实际情况调整。

另外，细胞裂解物在进行免疫(共)沉淀前，可先进行蛋白免疫印迹法检测，以此来确定细胞裂解物里存在目标蛋白。

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