酪酰胺信号放大(TSA,Tyramide signal amplification)技术是一种酶学检测方法，用于标记靶蛋白。该技术类似常规免疫组化的DAB显色方法，采用HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤，HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-HRP二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。
TSA详细原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增强。简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用TSA技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用同一来源的一抗。搭配对应的HRP二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。

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mIHC

1.样本准备：

1)石蜡切片：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-95%乙醇5min-85%乙醇5min-75%乙醇5min，蒸馏水洗。

2)冰冻切片：冰冻切片固定10-30min，PBS洗5min，重复3次，滴加0.3% triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重复3次。

3)细胞爬片或者细胞涂片：细胞样本固定10-30min，PBS洗5min重复3次，滴加0.3% triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重复3次。

2.抗原修复：组织切片置于盛满PH 9.0 EDTA碱性抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（也可以用高压1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他热修复方法）。中火8min，停火8min，转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定，冰冻切片和细胞样本可省略此步骤）。

3.阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育15 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4.非特异性靶点封闭：切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用抗体稀释液（或者其他封闭液 3%BSA 或者山羊血清）均匀覆盖组织，室温封闭30min。额外说明：抗体稀释液内含有各种保护剂以及防腐剂，可以用来封闭或者稀释一抗，稀释后的一抗可以长期四度保存（在常温下也可以保存一个月之久）

5.加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗X，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜或者37℃孵育1-2h（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

6.加多聚HRP二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的多聚HRP二抗覆盖组织，避光室温孵育50min，PBS洗三次。

7.TSA荧光染料反应液反应：直接滴加50μl即用型TYR-XXX荧光染料,TSA荧光染料反应液均匀覆盖组织室温反应 3-15min（最佳时间5min-10min），PBS洗三次（预实验可先染1min洗干净荧光染料后显微镜下观察染色效果，如果阳性弱继续滴加荧光染料加强染色强度直至合适强度后继续进行下一步）。

8.抗体洗脱：石蜡切片置于抗原修复液中95度水浴25-40min（根据不同抗体亲和力 灵活调整时间）或者滴加适量37度预热至完全溶解的mIHC专用抗体洗脱液（冰冻切片 爬片 骨组织建议用）覆盖样本，37度放置5-20分钟，弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本37度放置5-20分钟，弃洗脱液，PBS洗三次，每次5分钟（石蜡切片可用热修复洗脱或者抗体洗脱液洗脱，细胞及冰冻切片需用抗体洗脱液进行洗脱）

9. 重复3-8步骤：（换用另外一种TYR-XXX 荧光染料）---第2-6轮标记

10.DAPI复染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI即用型染液，避光室温孵育5min-20min。

11.封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片（我司有相应产品）。

12.镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。

1.在TSA荧光染料反应液反应步骤直接滴加50μl即用型TYR-XXX荧光染料进行孵育3-10min；
2.TSA+增强剂能够进一步增强荧光信号，放大5-10倍，TSA+增强剂不是必须的选项，可以根据具体的荧光显色强度选择是否添加。使用比例【TSA+增强剂:TRY-XXX荧光染料=1:500】。