本产品用于定性检测培养细胞、动物血清等生物制品中是否存在支原体、螺原体污染。

支原体是最小、最简单的原核生物，其大小介于细菌和病毒之间，约0.2-0.8μm，部分支原体能够通过0.22μm滤器，导致常规的过滤除菌失效。在生物研究和制药工业中，支原体污染细胞培养物已成为一个普遍和严重的问题，因此需要简单、快速、准确的方法来检测支原体污染。

本试剂盒基于实时荧光定量PCR平台，设计特异性引物和荧光探针，从而实现对支原体的高灵敏度高特异性检测。

置于-20℃条件下储存，有效期12个月。

2~10℃避光条件下储存或运输不得超过7天。-20℃储存时，冻融次数不超过5次。

1.5ml 离心管（用于配制PCR反应液和DNA提取）；

0.2ml PCR管或8联PCR管或96孔PCR板；

带滤塞的吸头（1ml、200μl和10μl）；

DNA提取试剂盒。

适用于ABI7500、SLAN-96S/P等型号的Real-time PCR扩增仪。

1.核酸提取

严格按照相关DNA提取试剂盒说明书提取核酸。提取过程中应采取必要的标记方法，避免试剂漏加及样本混淆。若需对核酸提取过程进行质控，可取5-10μL “MyP内参”加入样本中一起提取，建议最终洗脱体积50-100μL。

2.试剂准备

将试剂从冰箱取出，室温融化，充分混匀，1000rpm快速离心20秒，备用。

3.反应体系配制

(1)根据检测样本数计算所需反应数：

反应数（N）=（n个待测样本+1个阳性对照品+1个空白对照）×s重复次数+1

注：通常配制反应体系时，要比实际需要反应数多0.5或1个反应，避免分装过程中损失导致反应液不足。

(2)根据表2计算所需各反应液的体积，并配制反应体系，反应体系混匀后快速离心30秒，分装至PCR管中，每管20μl。

表1 加样表

注：若核酸提取中已加入“MyP内参”，则配制反应体系时，使用去离子水代替“MyP内参”。

4.加样

分别取10μl提取的样品DNA、阳性对照品和超纯水（空白对照）依次加入PCR反应管，盖上管盖，轻弹混匀，快速离心，排除管底气泡。

5.上机检测

(1)将PCR管按顺序放入PCR仪，设置反应程序

表2 PCR反应参数

注：ABI7500仪器设置时，FAM探针选择荧光基团FAM，淬灭基团MGB；ROX探针选择荧光基团ROX，淬灭基团MGB；参比荧光选择none。

(1)运行PCR反应程序，保存文件。

(2)反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节基线的Start值、End值以及Threshod值（用户可根据实际情况自行调整，调整阴性对照的扩增曲线使其平直或低于阈值线）。阈值线的设置原则以刚好超过阴性对照品检测荧光曲线和样本的荧光背景值的的最高点为准。

1.质量控制

表3质控样本结果分析

若质控品任意一项不符合表4要求，则本次实验无效，需重新检测。

2.待测样本检测结果分析

表4待测样本检测结果判读

注：待测样品的FAM通道扩增较强时（支原体DNA浓度较高），可能出现目的基因的扩增抑制内标基因的扩增，导致内标通道Ct值≥35或无典型扩增曲线，该情况结果仍然可信。

i.本试剂盒仅用于体外研究。实验前请仔细阅读说明书。

ii.实验过程中必须使用专用的移液枪和一次性带滤塞的加样吸头。

iii.PCR操作各阶段应在不同的分区进行，分别为试剂准备室、样本处理室和PCR扩增室。人、物单向流动。PCR试剂盒不应存放在样本处理区。

iv.加样时应使样品完全落入反应液中，不应有样品粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。

v.PCR操作各阶段使用专用的仪器和设备。

vi.扩增完毕立即取出反应管，密封在专用塑料袋内，丢弃于指定地点。

vii.实验前及实验完毕后应该对实验室进行紫外线消毒，并用70%乙醇擦拭工作台和微量加样器。

viii.试剂盒各组分应在有效期内使用，不同批次的试剂盒成分不得混用。