本试剂盒运用双抗体夹心ELISA 法定量测定小鼠血清、血浆、组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清或其它相关

生物液体中CSN1 含量。

将CSN1 抗体包被于96 孔微孔板中，制成固相载体，向微孔中分别加入标准品或标本，其中CSN1 与连接于固相

载体上的抗体结合，然后加入生物素化的CSN1 抗体，在将未结合的生物素化抗体洗净后，加入HRP 标记的亲和

素，再次彻底洗涤后加入TMB 底物显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的

黄色。颜色的深浅和样品中的CSN1 浓度呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（O.D.值），计算样品浓

度。

1.严格按照规定的时间和温度进行温育以保证准确结果。所有试剂都必须 在使用前达到室温20-25℃。使用后立即冷藏保存试剂。

2.洗板不正确可能导致不准确的结果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔干燥掉。

3.消除板底残留的液体和手指印 ，否则影响 OD 值。

4.底物显色液应呈无色或很浅的颜色 ， 已经变蓝的底物液不能使用。

5.避免试剂和标本的交叉污染以免造成错误结果。

6.在储存和温育时避免强光直接照射。

7.任何反应试剂不能接触漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会破坏试剂盒中反应试剂的生物活性。

8.不能使用过期产品 ，不同货号和批号组分不得混用。

9.试剂盒以外来源的重组蛋白可能会出现与本试剂盒抗体不匹配而不被识别的情况。

10.如果可能传播疾病 ，所有的样品都应管理好 ，按照规定的程序处理样品和检测装置。

1、450±10nm 滤光片的酶标仪（建议仪器使用前提前预热）

2、单道或多道微量移液器及吸头

3、稀释样品的EP 管

4、蒸馏水或去离子水

5、吸水纸

6、盛放洗液的容器

7、0.01mol/L（或1×）磷酸缓冲盐(PBS)，pH=7.0-7.2

1、血清：将收集于血清分离管中的全血标本在室温放置2 小时或4oC 过夜，然后1,000×g 离心20 分钟，取上

清即可，将上清置于-20oC 或-80oC 保存，避免反复冻融。

2、血浆：用EDTA 或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30 分钟内于2-8oC 1,000×g 离心15 分钟，

取上清即可检测，或将上清置于-20oC 或-80oC 保存，避免反复冻融。

3、组织匀浆：不同类型的组织制备匀浆的方法会有所不同

1） 取适量组织块，在预冷PBS（0.01mol/L， pH=7.0-7.2）中清洗去除血液，匀浆前先称重。

2） 将组织切成小块，均匀的放入放置在冰上的装有新鲜裂解缓冲液(货号IS007，应依据目标蛋白的亚细胞定

位选择不同类型的缓冲液)的玻璃均质器中（微小的组织也要如此）。（质量体积比=1:20-1:50，例如：

1mL 裂解缓冲液中加入20-50mg 组织样本。）

3） 将得到的悬浊液经过超声处理至澄清。

4） 将制备好的匀浆液10,000×g 离心5 分钟，弃沉淀，上清即可用于检测或置于-20oC 下保存。

4、细胞裂解液：在分析试验之前，细胞需利用以下方法处理：

1）贴壁细胞应该用冷PBS 轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，于1,000×g 离心5 分钟后收集。（悬浮细胞可通

过离心直接收集）。

2）将收集到的细胞用冷PBS 洗3 次；

3）将细胞用新鲜裂解缓冲液重悬至密度为10

7

个细胞/毫升，如果需要，细胞可以进行超声波处理至溶液澄清。

4）将标本于2-8oC 1,500×g 离心10 分钟，弃沉淀，上清即可用于检测或置于-20oC 下保存。

5、细胞培养上清或其它生物标本：请1,000×g 离心20 分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20oC 或-80oC 保

存，避免反复冻融。

注意：

1、以上标本均需密封保存，4oC 保存小于1 周，-20oC 不超过1 个月，-80oC 不超过2 个月。

2、标本出现溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。

3、标本使用前应缓慢均衡至室温，不应加热使之融解。

4、基于大量检测数据，我们推荐使用血清而不是血浆作为样本进行检测。

1、使用前将所有的试剂和标本缓慢均衡至室温（18-25oC），如果该试剂盒在一段时间内不能使用，请仅取出本

次试验所需的酶标条和试剂，并将剩余的酶标条及试剂按指定条件保存。

2、标准品（冻干品）：每瓶标准品加入标准品稀释液1mL，盖好后室温静置大约10 分钟，同时轻轻摇动（避免

起泡），其浓度为10ng/mL。准备7 个稀释标准品的EP 管，每个EP 管中加入500μL 的标准品稀释液，如图

所示依次倍比稀释成10ng/mL，5ng/mL，2.5ng/mL，1.25ng/mL，0.625ng/mL，0.312ng/mL，0.156ng/mL，标

准品稀释液（0ng/mL）直接作为空白孔。为保证实验结果的有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。

3、检测溶液A 及检测溶液B：Detection A 及Detection B 在使用前请用手甩几下或短暂离心处理，以使黏附

在管壁或瓶盖的液体沉积到管底。临用前分别以检测稀释液A 或B1:100 稀释(如：10μL 检测溶液A/990μL

检测稀释液A)，充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100μL/孔)，实际配制时应

多配制0.1-0.2mL。

4、浓洗涤液：580mL 蒸馏水或去离子水加入20mL 洗涤液（30×）稀释至600mL 至工作液浓度。

5、底物溶液：请用灭菌的移液器和吸头吸取所需体积的TMB 至另一干净容器中使用，容器中剩余的底物应予丢

弃，不要倒回TMB 瓶中。

注意：

1、标准品的稀释不能直接在板中进行。

2、标准品请于临用前15 分钟内配制。该标准品只能使用一次。

3、标准品、检测溶液A 工作液、检测溶液B 工作液请使用相应的稀释液配制，稀释液不能混用。用移液枪轻轻

吹打充分混匀，避免起泡。为保证实验结果的准确性请使用微量吸管，并校准微量移液器。请依据所需的量

精确配制，尽量不要使用微量配制的方法（如吸取检测溶液A 时，一次不要小于10μL），以避免造成浓度误

差。

4、请勿重复使用已经稀释过的标准品、检测溶液A 工作液和检测溶液B 工作液。

5、洗涤液（30x）中如有结晶析出，请先温育至室温，轻轻混匀，至到结晶完全溶解再进行配制。

6、试剂盒中部分试剂为储存液，客户需配置成工作液后使用，在配置过程中可能因为纯净水质量差或水质污染，

以及实验中所用耗材洁净度差，造成实验结果不准确，甚至完全错误。请使用双蒸水配置。

5、每孔加检测溶液B 工作液（临用前配制）100μL，酶标板覆膜，37oC 温育30 分钟。

6、弃去孔内液体，甩干，洗板5 次，方法同步骤4。

7、每孔加TMB 底物溶液90μL，酶标板覆膜，37oC 避光显色（反应时间控制在10-20 分钟，不要超过30 分钟。

当标准孔的前3-4 孔有明显的梯度蓝色，后3-4 孔梯度不明显时，即可终止）。

8、每孔加终止溶液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相

同。如出现颜色不匀一，请轻轻晃动酶标板以使溶液混合均匀。

9、在确保酶标板底无水滴及孔内无气泡后，立即用酶标仪在450nm 波长测量各孔的光密度值（O.D.值）。

注意：

1、试剂准备：准备一次实验所需要的酶标条，其它的可从微孔板上拆下，密封，按照说明书要求保存，以备下

次使用。

2、加样：实验操作中请使用一次性的灭菌吸头，避免污染。加样时注意不要有气泡产生，将样品加于酶标板底

部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。与反应试剂加入一样，加样过程中第一个孔与最后一个孔加样时间间

隔尽量小（一般控制在10 分钟以内），如果太大，将会导致不同的“预温育”时间，从而明显地影响到测量

值的准确性及重复性。为了测值的准确性，推荐设置复孔进行实验。

3、温育：为防止样品蒸发，实验时请将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发，洗板后应尽快进

行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态，同时应严格遵守给定的温育时间和温度。

4、洗涤：充分洗涤非常重要，在每次洗涤过程中，都要将洗涤液完全甩干。洗涤过程中反应孔内残留的洗涤液

应在吸水纸上拍干，勿将吸水纸直接放入反应孔中吸水，同时要轻轻擦除板底残留的液体和手指印，避免影

响最后的酶标仪读数。如果使用自动洗板机，请在熟练使用后再用于正式实验过程中。

5、反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化（比如，每隔10 分钟观察一次），如观察到颜色

较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强而影响酶标仪光密度读数。

6、底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。

7、如果实验室内湿度低于60%，推荐使用加湿器提高湿度水平。

结果判断：

1.计算标准品和样本复孔的平均 OD 值并减去空白孔的 OD 值作为校正 值。 以浓度为横坐标 ，OD 值为纵坐标 ，在双对数坐标纸上绘出四参数 逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)。

2.若样品 OD 值高于标准曲线上限 ，应适当稀释后重测并在计算样本浓度 时乘以相应的稀释倍数。

典型数据和参考曲线：

以下数据和曲线仅供参考 ，实验者需根据自己的实验建立标准曲线。

注意 ：本图仅供参考 ，应以同次试验标准品所绘标准曲线计算标本含量。

0.156ng/mL-10ng/mL

0.058ng/mL

此值为20 个空白样品（即标准品稀释液）测定的平均值加二倍标准差所对应的浓度。